آشنایی با آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ( High Performance Liquid Chromatography) روشی بسیار کاربردی برای جداسازی، شناسایی و اندازه گیری مقادیر اندک یک نمونه است. آنالیز HPLC که قبلاً به آن کروماتوگرافی مایع با فشار بالا گفته می شد روشی در شیمی تجزیه است که برای شناسایی و تعیین کمیت هر یک از اجزای موجود در یک مخلوط استفاده می شود.
آنالیز HPLC به پمپ های انتقال یک حلال مایع تحت فشار حاوی نمونه از طریق ستونی که با ماده جاذب جامد پر شده است، متکی است. هر یک از اجزاء موجود در نمونه با ماده جاذب بطور متفاوتی واکنش داده و باعث ایجاد جریان متفاوتی برای اجزای نمونه می شود که منجر به جدا شدن آنها می شود. در ادامه بحث با ما در نشریه جهان شیمی فیزیک همراه باشید.
اصول کار آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا چیست؟
در آنالیز HPLC نمونه ای که باید جداسازی و بررسی شود در مقادیر بسیار اندک از طریق یک ستون به جریان فاز متحرک تزریق می شود. ستون های مختلفی وجود دارد که دارای جاذب هایی با اندازه و سطوح مختلفی از ذرات هستند.
مخلوط حاوی نمونه با سرعت های متفاوتی از ستون عبور کرده و با ماده جاذب که به عنوان فاز ثابت شناخته می شود، واکنش می دهد. سرعت هر جزء در مخلوط به ۱) ماهیت شیمیایی آن ، ۲) ماهیت ستون و ۳) ترکیب فاز متحرک بستگی دارد. زمانی که یک آنالیت خاص در ستون پدیدار می شود ، به عنوان زمان بازداری شناخته می شود. مدت زمان بازداری تحت شرایط خاص اندازه گیری می شود و به عنوان مشخصه شناسایی یک آنالیت معین در نظر گرفته می شود.
ذرات جاذب ممکن است از نظر طبیعت آبگریز یا قطبی باشند. فازهای متداول مورد استفاده شامل ماده قابل ترکیب با آب و حلال های آلی مانند استونیتریل و متانول است. از فازهای متحرک بدون آب نیز می توان استفاده کرد.
بهتر است بدانید
اجزاء محلول فاز متحرک ممکن است حاوی اسیدهایی مانند اسید فرمیک ، اسید فسفریک یا تری فلوئوراستیک و یا نمک باشد تا جداسازی اجزای نمونه را فعال کند. ترکیب فاز متحرک در طول کروماتوگرافی می تواند به صورت ثابت یا متغیر حفظ شود.
روش ثابت برای جداسازی اجزای یک نمونه که از نظر میل برای فاز ثابت خیلی متفاوت نیستند، مؤثر است. در روش متغیر ، ترکیب فاز متحرک از استحکام شستشوی کم تا زیاد متفاوت است. استحکام شستشوی فاز متحرک توسط زمان های بازداری آنالیت منعکس می شود که در آن قدرت شستشوی زیاد باعث شستشوی سریع می شود. ترکیب فاز متحرک بر اساس شدت برهم کنش بین چندین جزء نمونه و فاز ثابت انتخاب می شود.
شایان ذکر است که فرایند پارتیشن بندی HPLC کاملاً مشابه فرایند استخراج مایع – مایع است به جز اینکه اولی یک فرایند مداوم است و روش دوم یک فرایند گام به گام است. توصيه می شود از فرآيندهای پارتیشن بندی برای تعيين روش دقيق HPLC كه امکان جداسازی كافی نمونه را فراهم می كند، استفاده شود.
مزایای آنالیز HPLC
- مزایای اصلی سیستم های HPLC به شرح زیر است:
- کنترل دقیق و خودکار کروماتوگرافی
- مدیریت داده ها ، ویژگی های امنیتی و گزارش دهی و اعتبار سنجی
- آنالیز HPLC قدرتمند و سازگار است
- مدیریت تمام زمینه های آنالیز- از نمونه گرفته تا ابزار و جداسازی تا نتایج گزارش و بهره وری را افزایش می دهد.
- آنالیز HPLC مقرون به صرفه است.
کاربردهای آنالیز HPLC
هدف اصلی تکنیک HPLC شناسایی ، تعیین کمیت و خالص سازی یک آنالیت یا ترکیب خاص است. تجزیه و تحلیل کمی و هم کیفی با HPLC قابل انجام است و می توان آنرا برای موارد زیر استفاده کرد:
- تصفیه آب
- تشخیص ناخالصی ها در صنایع داروسازی
- تعیین غلظت اولیه عناصر کمیاب
- کروماتوگرافی تبادل لیگاند
- کروماتوگرافی تبادل یونی پروتئین ها
- کروماتوگرافی تبادل آنیون با pH بالا برای کربوهیدرات ها و الیگوساکاریدها
بخش های مختلف دستگاه آنالیز HPLC
پمپ HPLC
پمپ HPLCمهمترین بخش دستگاه است و پمپاژ حلال و یا حلال ها با فشار بسیار بالا تا حدود ۴۰ مگا پاسکال و یا بیشتر را به سمت ستون کروماتوگرافی انجام می دهد. پمپ می تواند از یک تا چهار حلال را به سمت ستون پمپاژ می نماید که بسته به روش کار تغییر می کند. در مواقعی که از یک حلال در دستگاه HPLC استفاده می شود به آن ایزوکراتیک یا تک حلاله گفته می شود.
در مواقعی که از ترکیب ثابت دو یا چند حلال و یا ترکیب متغیر با برنامه زمانی استفاده شود به این سیستم باینری و یا کواترنری یا چند حلاله و یا گرادیانت می گویند.
انژکتور HPLC
انژکتور ابزار تزریق کننده نمونه به داخل حلال عبوری در دستگاه کروماتوگراف است. این بخش سیستمی است متشکل از چند مسیر که بین پمپ و ستون قرار گرفته و می تواند در حین عبور حلال یا فاز حامل با فشار زیاد مقدار معینی از نمونه را به داخل آن هدایت نماید.
مقدار ثابت نمونه در داخل لوله ای با حجم مشخص بنام لوپ قرار می گیرد تا در لحظه فرمان کاربر سوار موج حلال شده و به سمت ستون کروماتوگرافی حرکت نماید. انژکتور اتوماتیک و یا Autosampler نیز نوع رباتیک این سیستم می باشد که می تواند تعداد بسیار زیادی از نمونه را طبق برنامه به داخل حلال تزریق نماید.
ستون HPLC
ستون کروماتوگرافی مرکز جداسازی اجزای نمونه و به صورت لوله ای است که با مواد نیمه تراوا از جنس خاک دیاتومه با خلل و فرج فراوان پر شده است. حلال و نمونه حل شده تنها با اعمال فشار از داخل آن عبور داده می شود.
این ستون ها در واقع کار نگهداری و رها سازی مولکول های موجود در ترکیب را به ترتیب بزرگی و یا چسبندگی مولکول ها و قدرت شستشوی نمونه توسط حلال انجام می دهند. ستون ها بسته به جنس محتوا و قطبیت و طول دارای انواع بسیار متنوعی هستند.
آشکار ساز یا Detector
دتکتور غلظت نمونه را دستگاه کروماتوگراف مایع اندازه گیری می کند. در بیشتر موارد دتکتور یک سیستم اسپکتروفتومتر است که در یک طول موج خاص مقدار و نوع نمونه را مشخص می کند.
کنترل کننده Controller
کنترل کننده بخشی است که ماژول های دیگر را کنترل نموده و ارتباط همه بخش ها و کامپیوتر را برقرار می نماید. در پایان اطلاعات اجزای ترکیب به صورت نمودار یا اصطلاحاً کروماتوگراف روی نمایشگر قابل دستیابی است.
دگسر Degasser
قبل از ورود حلال به داخل پمپ باید هر گونه حباب هوا ، گاز و یا هوای حل شده در حلال را در آن از بین برد . این کار به دو روش تزریق گاز بی اثر مثل آرگون در داخل حلال در حین تکان دادن حلال یا استفاده از دستگاه گازگیر یا دگسر صورت می گیرد. که استفاده از دستگاه Degasserمتداول تر است.
از دیگر بخش های یک دستگاه آنالیز HPLC می توان به کنترل کننده دمای ستون و میکسر اشاره کرد که حلال ها و نمونه را قبل از تزریق به ستون به صورت همگن مخلوط می نماید.
هزینه و دقت آنالیز HPLC
HPLC در علوم آزمایشگاهی و بالینی کاربردهای زیادی دارد و به عنوان یک روش متداول در توسعه داروسازی مورد استفاده قرار می گیرد ، زیرا روشی قابل اعتماد برای به دست آوردن و اطمینان از خلوص محصول است. با اینحال HPLC در مقیاس بزرگ می تواند یک روش گران قیمت باشد و افزایش ویژگی ، دقت و صحت HPLC باعث افزایش هزینه ها خواهد شد.
