معرفی کروماتوگرافی اندازه طردی و موارد استفاده از آن
کروماتوگرافی اندازه طردی (Size Exclusion Chromatography) نمونه‌ای از انواع کروماتوگرافی است. کاربرد کروماتوگرافی اندازه طردی برای جداسازی مولکول هایی با اندازه و سایز و شکل متفاوت از یکدیگر مورد استفاده قرار می گیرد. از مزایا کروماتوگرافی عدم تغییر در ساختار مولکول ها بوده و از این جهت به عنوان یک روش ملایم در جداسازی بشمار می آید. کروماتوگرافی ژل تراوایی و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی از دیگر نام های این روش کروماتوگرافی هستند. استفاده از کروماتوگرافی اندازه طردی برای جداسازی و آنالیز ترکیبات با جرم مولکولی بالا کارایی مطلوبی دارد. جالب است بدانید کروماتوگرافی اندازه طردی از انواع روش های کروماتوگرافی مایع بشمار آمده و از لحاظ دستگاه وری مشابه با روش HPLC است. از مزایا روش SEC زمان آنالیز کوتاه، جداسازی مطلوب و حساسیت مناسب آن است. از معایب کروماتوگرافی اندازه طردی نیز می توان به عدم توانایی آن در جداسازی ذرات با اندازه یکسان اشاره نمود.
نشریه علمی جهان شیمی فیزیک قبلا به بررسی انواع کروماتوگرافی، کروماتوگرافی مایع، کروماتوگرافی گازی و… پرداخته است. در ادامه این مطلب به بررسی کاربرد کروماتوگرافی اندازه طردی و نحوه استفاده از آن می پردازیم.
کروماتوگرافی اندازه طردی چیست
کروماتوگرافی اندازه طردی را با نام های کروماتوگرافی ژل تراوایی و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی نیز می شناسند. می توان گفت کروماتوگرافی اندازه طردی در سال ۱۹۵۴ معرفی و استفاده از آن در سال ۱۹۵۹ توسعه یافت. این نوع از کروماتوگرافی در جداسازی و آنالیز ترکیباتی با جرم مولکولی بالا تکنیکی قوی محسوب می شود. اندازه و شکل مولکول ها مبنای جداسازی بر مبنای این روش است. برهمکنش‌های شیمیایی یا فیزیکی آنالیت با فاز ساکن در این جداسازی دخالت نداشته، و مهم تر اینکه به علت کاهش کارایی ستون باید از این برهم کنش ها ممانعت شود.
بنابراین می توان کروماتوگرافی اندازه طردی را یک روش آزمایشگاهی دانست که در جداسازی مواد بر اساس اندازه آن‌ها در محلول کارایی دارد. این روش بدون اینکه برهمکنش شیمیایی میان مولکول‌های نمونه و سطح رزین‌ها ایجاد کند، آن ها را به خوبی جداسازی خواهد نمود.
مولکول های محلول در این روش از یک سیال ژلی یا ماده معدنی غیرقابل انعطاف تشکیل یافته از رزین یا ماتریکس های متخلخل با اندازه‌های مشخص عبور داده می شوند. به این ترتیب مولکول های کوچک تر درون حفره رفته و مولکول های بزرگ تر از لابه‌لای بیدهای ستون (رزین یا ماتریکس) خارج خواهند شد. بر طبق این جداسازی مولکول‌هایی که در مراحل اول، از بید خارج می شوند، دارای اندازه و وزن مولکولی بیشتری نسبت به مولکول‌های دیگر موجود در نمونه دارند.
بنابراین می توان این طور گفت که کروماتوگرافی اندازه طردی براساس تفاوت در زمان خروج مولکول ها از ستون طراحی شده است و با این روش آن‌ها را از یکدیگر جداسازی می کند.
معایب و مزایا کروماتوگرافی اندازه طردی
- زمان آنالیز نمونه در آن کوتاه است.
- جداسازی و حساسیت مطلوبی دارد.
- هم دارای قابلیت اندازه گیری کمی و هم شناسایی کیفی است.
- از دست رفتگی نمونه به دلیل عدم برهم کنش نمونه با فاز متحرک و ساکن وجود ندارد.
- ستون آن عمر بالاتری نسبت به سایر انواع ستون های کروماتوگرافی دارد. زیرا برهمکنش نمونه با فاز ساکن غیرفعال نمی‌گردد.
از معایب این روش نیز می توان به این نکته اشاره نمود که به دلیل زمان کوتاه آنالیز، کروماتوگرام تعداد پیک های محدودی خواهد داشت. عدم توانایی جداسازی ترکیبات هم اندازه مثل ایزومر ها از سایر معایب کروماتوگرافی اندازه طردی محسوب می‌شود.
عملکرد کروماتوگرافی اندازه طردی
کروماتوگرافی اندازه طردی از انواع کروماتوگرافی مایع محسوب می گردد. این نوع از کروماتوگرافی را ازلحاظ دستگاهوری و اجزا می توان مشابه با روش HPLC دانست؛ البته تفاوت های دستگاهی نیز بین این دو روش وجود دارد.
مواد متخلخل با اندازه منافذ كنترل شده به عنوان فازهای ساکن در کروماتوگرافی اندازه طردی استفاده می شوند. بر اساس اختلاف در اندازه مولکولی اجزای نمونه از هم تفکیک می شوند. فاز ساکن در این روش را این طور می توان توضیح داد که شبیه یک الک مولکولی رفتار می کند. به طوری که مولکول های کوچک تر از اندازه منافذ فاز ساکن وارد آن ها گشته و مولکول های بزرگ تر از اندازه منافذ، طرد می گردند. در این نوع کروماتوگرافی تعریفی به نام حد طرد وجود دارد. حد طرد به بالاترین جرم مولکولی از یک گونه گفته می شود که می تواند به منافذ وارد شود.
با توجه به توضیحات بالا مولکول های بزرگ تر از حد طرد نمی توانند توسط ستون بازداری شوند. بنابراین به سرعت از ستون خارج می شوند. مولکول های کوچک تر نیز در داخل و خارج از منافذ پخش گشته و دیرتر خارج می یابند. درنهایت این روش جداسازی قادر است تا مولکول هایی با اندازه های مختلف را با سرعت های متفاوت از ستون خارج کند.
نحوه خروج مولکول ها از ستون
جالب است بدانید درصورتی که مواد ترکیب شیمیایی مشابهی داشته باشند، به ترتیب جرم مولکولی نسبی از ستون شسته و خارج می شوند. همان‌طور که می‌دانید اندازه مولکول با جرم آن نسبت مستقیم دارد. بنابراین مولکولی های با وزن کمتر نسبت به مولکول هایی با جرم زیاد بیشتر در ستون نگه داشته می شوند.
درنهایت می توان گفت پیک های ابتدایی در کروماتوگرام SEC به مولکول های بزرگ‌تر و پیک‌های پایانی به مولکول های کوچک تر مربوط می شوند. این روش یکی از روش های جداسازی مناسب در ترکیبات در فرم محلول بشمار می‌آید.
کاربرد کروماتوگرافی اندازه طردی
این روش به‌عنوان انواعی از کروماتوگرافی با وضوح کم در نظر گرفته می شود. این روش درواقع نمی تواند مولکول های مشابه را از هم جداسازی نماید. اما با وجود این عیب روشی مطلوب برای جداسازی مولکول هایی است که با روش‌های کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز جداسازی نگشته اند. از طرفی کاربرد کروماتوگرافی اندازه طرد برای تفکیک نهایی مولکول‌ها از یکدیگر یا مرحله Polishing استفاده می شود. در ادامه به برخی از کاربرد های روش SEC اشاره شده است. با ما در جهان شیمی فیزیک همراه باشید.
جداسازی و بررسی پروتئین ها و پلیمر های محلول در آب
- نمک زدایی یا (Desalting)
- تعویض بافر یا (Buffer Exchange)
- خالص سازی شکر و پلی پپتید‌ها
- تعيين توزيع وزن مولکولی
- تصفیه و خالص سازی نمونه های بیولوژیکی همچون آنزیم ها، پروتئین ها، و اسیدهای نوکلئیک، ویروس ها، هورمون ها و…
- کاربرد در صنعت پلیمر و کنترل کیفی
- کاربرد در جداسازی همولوگ ها و الیگومرها
- و…
عوامل موثر بر کروماتوگرافی اندازه طردی
عوامل مختلفی بر نحوه عملکرد روش SEC تاثیر دارند. در ادامه به بررسی برخی از مهم ترین عوامل موثر بر این نوع کروماتوگرافی اشاره شده است.
ترکیبات بافر
از مهم ترین عواملی که بر رزولوشن کروماتوگرافی تاثیر دارند، ترکیبات بافر و نمونه هستند. میزان گروه های باردار و آبگریز و همین طور سایز آن‌ها جداسازی را تحت تاثیر قرار می دهند. بافرهایی که برای جداسازی استفاده می شوند با توجه به نوع نمونه آماده سازی می شوند. بافرهایی که برای جداسازی پروتئین ها استفاده می‌شوند، پی اچی بین ۶ تا ۸ دارند، زیرا اغلب پروتئین‌ها در این pH پایدارند.
عواملی همچون قدرت یونی بافر نیز بر جداسازی به روش SEC موثر است. قدرت یونی بالا می تواند موجب کاهش زمان بازداری در پروتئین هایی با بار مثبت و موجب افزایش بازداری در پروتئین‌هایی با بار منفی گردد. البته اگر قدرت یونی خیلی زیاد باشد نیز ممکن است موجب شود تا پیوند هیدروفوب (آبگریز) بین رزین و پروتئین زیاد شود. این موضوع می تواند بر زمان بازداری، ناحیه پیک و رزولوشن تاثیر داشته باشد. برای انجام یک جداسازی مطلوب با روش SEC محلول بافر باید دارای ویژگی های زیر باشد.
- در تهیه بافر باید از آب و مواد شیمیایی با کیفیت استفاده شود.
- قبل از استفاده از محلول بافر، باید گازهای موجود در آن خارج شوند. زیرا حباب‌ها ممکن است منافذ رزین را مسدود نمایند.
- بافر و ستون باید از دمای یکسانی برخوردار باشند. تغییر ناگهانی دما منجر به ایجاد حباب در رزین‌ها گشته و این موجب کاهش کیفیت کروماتوگرافی SEC می گردد.
- نمونه مورد جداسازی باید شفاف و فاقد هرگونه ذرات قابل دید باشد.
گرانروی نمونه
افزایش گرانروی نمونه بر میزان رزولوشن کروماتوگرافی تاثیری ندارد. اما افزایش گرانروی می تواند فشار پشت ستون را افزایش دهد. بنابراین برای نمونه هایی با گرانروی بالا یا دمای کم باید از سرعت جریان کم استفاده نمود. بعلاوه برای جداسازی بهتر نمونه نیز باید رقیق شود. آلبومین مثالی از این دسته بوده و غلظت آن در سرم انسان اغلب نباید بیش از ۷۰ mg/mL باشد. البته گرانروی با تغییر دما نیز تغییر خواهد نمود.
حجم نمونه
در کروماتوگرافی SEC برای اینکه نتیجه مطلوب حاصل آید، حجم نمونه باید حدود ۰٫۳٪ از حجم بستر باشد. در برخی از نمونه‌ها که پیک ها به خوبی از هم جدا می‌شوند، می‌توان حجم نمونه را افزایش داد.
سرعت جریان
سرعت جریان یکی از عوامل مهم است که می تواند بر رزولوشن کروماتوگرافی تاثیر بگذارد. این عامل در جداسازی پروتئین‌ها از اهمیت بالایی برخوردار است. درصورتی که کروماتوگرافی تفکیک کمی بین پیک های پروتئین نشان دهد، باید سرعت جریان را کاهش داد.
سرعت کم جریان به مولکول های کوچک این فرصت را می دهد که در منافذ رزین نفوذ کرده و تفکیک بهتری صورت پذیرد. توجه شود که ممکن است کم کردن سرعت جریان در نمونه هایی با مولکول های کوچک اثر نامطلوبی بر تفکیک آن‌ها خواهد داشت.
مزایا و کاربرد کروماتوگرافی اندازه طردی در نمک زدایی از محلول ها
از دو روش دیالیز و کروماتوگرافی می توان برای نمک زدایی از محلول ها استفاده نمود. البته مزایا استفاده از کروماتوگرافی اندازه طردی در نمک زدایی از محلول ها نسبت به روش دیالیز بیشتر بوده و مناسب تر است. در روش دیالیز از حجم زیادی از بافر استفاده می شود. این موجب می شود تا سرعت نمک زدایی پایین بیاید. از دیگر معایب روش دیالیز از دست رفتن نمونه است. استفاده از روش کروماتوگرافی SEC می‌تواند مشکلات روش دیالیز را حل کند.
- با استفاده از کروماتوگرافی اندازه طردی برای نمک زدایی می توان ۳۰٪ از حجم ستون را از حجم نمونه پر کرد. شرکت‌های سازنده برای راحتی کار ستون‌های آماده ای را در بازار ارائه می دهند که نمک زدایی را در ستون‌های کوتاه ممکن می سازد. این ستون‌ها سرعت نمک زدایی بالایی و اغلب کمتر از ۵ دقیقه دارند.
- در روش SEC بازیابی زیست مولکول‌ها معمولا بالای ۹۵٪ صورت می پذیرد. توجه شود که نوع مولکول نمونه، نوع ستون و روش خالص سازی در بازیابی مولکول بسیار مهم هستند. غلظت پایین مولکول ها در نمونه مورد نظر اغلب موجب کاهش بازیابی آن ها می شود.
بیشترین استفاده از کروماتوگرافی طردی
این نوع کروماتوگرافی بیشتر جهت جداسازی پروتئین ها از مولکول های کوچک تر، نمک زدایی و تعویض بافر مورد استفاده قرار می گیرد. مولکول هایی با اندازه کوچک به داخل منافذ رفته و مولکول های بزرگ بدون ورود به این منافذ از ستون خارج و این‌گونه جداسازی صورت می پذیرد. از تفاوت زمان خارج شدن مولکول ها، می توان برای جداسازی یا خالص سازی نمونه استفاده نمود.استفاده کرد.
دستگاهوری کروماتوگرافی اندازه طردی
فاز ساکن
در SEC از دو نوع فاز ساکن استفاده می شود. این دو فاز شامل دانه های پلیمری و ذرات پایه سیلیکایی هستند. این دانه ها اغلب دارای قطری بین ۵ تا۱۰ میکرومتر هستند. ذرات با پایه سیلیکا راحت تر فشرده گشته و در فشار بالا نیز قابل استفاده هستند. این ذرات دارای پایداری بالایی بوده و امکان استفاده از حلال های مختلف مانند آب در آن‌ها امکان پذیر است. این ذرات تعادل سریعی داشته و پایداری خوبی در دمای بالا دارند. البته توجه شود که این ذرات تمایل به جذب سطحی حل شونده ها داشته و بعلاوه توانایی کاتالیز تخریب مولکول های حل شونده را نیز دارند.
کوپلیمر استیرن دی وینیل بنزن یکی از فازهای ساکن متداول در انواع کروماتوگرافی اندازه طردی است. اندازه منافذ این پلیمرها در حین سنتز پلیمر قابل کنترل بوده و از این رو این پلیمر با اندازه های منافذ مختلفی در دسترس است. ژل های استیرن دی وینیل بنزن آب گریز بوده و تنها با فاز ساکن غیرآبی مورد استفاده قرار می گیرد. پلی اکریل آمیدها یا دی وینیل بنزن سولفونه شده از ژل های آب دوست بوده که برای جداسازی مولکول های محلول در آب به کار می روند.
آشکار ساز
در کروماتوگرافی SEC آشکارساز ضریب شکست از متداول ترین نوع آشکارسازها بشمار می آید. آشکارساز پراش نور، آشکارساز مادون قرمز و آشکارساز ماورای بنفش نیز در مواردی استفاده می شوند که آشکارساز RI کارایی نداشته باشد. آشکارسازهای دیگر همچون آشکارساز فلورسانس و الکتروشیمیایی در این روش کمتر به کار گرفته می شوند.
سخن آخر
در این مطلب از جهان شیمی فیزیک به بررسی یکی از انواع کروماتوگرافی مایع به نام کروماتوگرافی اندازه طردی پرداختیم. این کروماتوگرافی از روش های جداسازی مهم به‌ویژه در جداسازی پروتئین‌ها است. این روش جداسازی را برمبنای اندازه و شکل ذرات نمونه انجام می دهد.
