کروماتوگرافی ستونی (Column Chromatography) یکی از روش های کروماتوگرافی می باشد که به کمک فاز ساکن جهت جداسازی، تفکیک و تجزیه و تحلیل انواع ترکیبات پیچیده آلی کاربرد دارد. این نوع از کروماتوگرافی جایگاه ویژه ای در آماده سازی و کنترل واکنش ها در سنتز آلی پیدا کرده است. در مقالات پیشین نشریه جهان شیمی فیزیک، درباره آنالیز کروماتوگرافی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، گاز کروماتوگرافی، کروماتوگرافی لایه نازک و کروماتوگرافی کاغذی مطالبی را مطرح کرده ایم. در این مقاله به معرفی کروماتوگرافی ستونی، انواع و کاربرد های آن در آزمایشگاه پرداخته می شود. لطفا با ما همراه باشید.
کروماتوگرافی ستونی چیست؟
در كروماتوگرافی ستونی ذره بين دو فاز مايع و جامد پخش می شود. در این تکنیک، فاز ساکن در داخل لوله ای باریک که ستون نامیده می شود ثابت می گردد. بعد از آن، فاز متحرک به کمک نیروی گرانش یا با استفاده از یک نیروی خارجی حاصل از پمپ از درون ستون عبور می کند. در واقع فاز ساکن، یک جامد است که اجزای مایعی (فاز متحرک یا حلال) را که از آن عبور می کند را به صورت انتخابی در سطح خود جذب می نماید.
نیرو هایی که سبب جذب سطحی در این نوع کروماتوگرافی می شوند، در واقع همان نیرو هایی می باشند که باعث جذب در مولکول ها می گردند (مثل نیروهای ایجاد کمپلکس، پیوند هیدروژنی، نیرو های واندروالس و جاذبه های الکترواستاتیکی).
نحوه عمل کروماتوگرافی ستونی نیز همچون سایر روش های کروماتوگرافی می باشد. در حقیقت برای جدا سازی مخلوط با این نوع کروماتوگرافی، ستون را با یک جسم جامد فعال مثل آلومینا یا سیلیکاژل پر نموده و مقداری از نمونه مایع را روی آن قرار می دهند. نمونه مورد نظر در ابتدا در بالای ستون کروماتوگرافی جذب می شود. حال حلال استخراج کننده را در داخل ستون عبور می دهند. فاز متحرک، اجزای نمونه را با خود جابجا می کند. ذرات با تمایل جذب پایین تر، نسبت به ذرات با چسبندگی بیشتر، تند تر حرکت نموده و سریع تر از ستون خارج می شود. در نهایت به دلیل تفاوت سرعت حرکت آنها، جداسازی انجام می شود. در واقع، هدف این کروماتوگرافی نیز ظاهر شدن نقاطی است که به خوبی از هم جدا شده باشند.
اساس کروماتوگرافی ستونی
کروماتوگرافی ستونی معمولا به سه دلیل روش بسته بندی ساده، فشار کاری کم و همچنین هزینه کم برای ابزار اهمیت زیادی دارد. این کروماتوگرافی بر اساس اجزا، به شرح زیر می باشد.
- جاذب های مناسب (فاز ساکن یا فاز ثابت)
- حلال ها یا مخلوط های حلال به عنوان فاز متحرک یا فاز شوینده
- مولکول های نمونه یا آنالیت
فاز ثابت یا فاز ساکن
تعدادی از جاذب های جامدی که معمولا در داخل ستون این نوع کروماتوگرافی کاربرد دارند عبارتند از: آلومینا، سیلیکاژل، فلورسین، زغال چوب، کربنات کلسیم، اکسید منیزیم، نشاسته و شکر. برای اينكه جاذب نيروی موثر تری داشته باشد، بايستی اندازه ذرات آن يكنواخت و سطح مخصوص نیز زياد باشد. چنين سطح زیادی سبب می شود که تعادل جسم در دو فاز سريع انجام شود.
متداول ترین جاذب های مورد استفاده آلومینا وسیلیکاژل می باشند. آلومينا (Al۲O۳) در واقع یک تركيب قطبي بسيار فعال می باشد كه قدرت جذب زيادی دارد. این ترکیب به سه صورت موجود است که عبارتند از: حالت خنثی، شسته شده با اسيد و شسته شده با باز. آلومينای مدل بازی برای تركيبات اسيدی و آلومينای مدل اسيدی برای تركيبات بازی قدرت جداسازی خوبی را نشان می دهند. از طرف دیگر، در تركيباتی كه به محیط های اسيدی و یا بازی حساسيت دارند و ممکن است واكنش شيميايی بدهند بايد از مدل آلومينای خنثی استفاده نمود.
فاز متحرک (حلال)
می توان گفت که انتخاب مناسب حلال، مهم ترین بخش یک کروماتوگرافی خواهد بود. بهترین حلال، حلالی است که بیشترین فاصله را بین اجزا ایجاد نماید. انتخاب حلال معمولا از طریق تجربه بدست می آید. اما بهترین حلال یا مخلوط آنها که به روش کروماتوگرافی لایه نازک بدست می آید برای کروماتوگرافی ستونی نیز مناسب می باشد.
اگر یک ذره در حلال مشخص نا محلول باشد، در حالیکه ذره دیگر، به خوبی در آن حل شود، تفکیک خوبی خواهید داشت. از این رو، قطبیت حلال استخراجی باید کمتر از اجزای مخلوط باشد. همچنین ذرات مخلوط بایستی در حلال حل شوند، زیرا در غیر این صورت ذرات در فاز ساکن ستون جذب شده و در آن باقی خواهند ماند. قدرت استخراجی (توانایی حلال در انتقال یک ذره مشخص به پایین ستون) حلال های هگزان، تترا کلرید کربن، تولوئن، بنزن، دی کلرو متان، کلرو فرم، دی اتیل اتر، اتیل استات، استون، پروپانول، اتانول، متانول و آب به ترتیب زیاد می شود.
مراحل کروماتوگرافی ستونی
تهیه ستون کروماتوگرفی
در ابتدا نیاز است تا ستون کروماتوگرافی تهیه شود. برای اینکار یک بورت را در حالت عمودی به گیره وصل کنید. توجه داشته باشید که شیر بورت بسته باشد. حال بورت را با اتر نفت تا نزدیکی ۴۰ میلی لیتری آن پر نموده و با استفاده از یک لوله شیشه ای بلند، کمی پشم شیشه را در انتهای بورت قرار دهید. درون بورت مورد نظر، تا ارتفاع ۱ سانتی متری بالای پشم شیشه را شن بریزید.
منتظر بمانید تا حباب های درون شن کامل خارج شوند. حالا در حالیکه به دیواره بورت به آرامی ضربه می زنید، ۱۵ گرم از آلومینا را به داخل لوله بورت ریخنه و در هنگام پایین رفتن آلومینا، ستون را کاملا تکان دهید. این عمل در واقع به پر شدن یکنواخت ستون کروماتوگرافی کمک خواهد کرد. دیواره داخلی بورت را که احتمالا آلومینا به آن چسبیده است را با اتر نفت اضافی کامل بشویید. برای حفاظت از آلومینای پر شده داخل ستون کروماتوگرافی، یک لایه یک سانتی متری شن در بالای ستون کروماتوگرافی قرار دهید.
حال شیر بورت را باز نموده و اجازه دهید تا حلال خارج شده و به بالای لایه شن بالایی برسد. حالا می توان گفت که ستون کروماتوگرافی برای جداسازی نمونه مورد تفکیک آماده می باشد. لازم به ذکر است که طريقه پر كردن ستون کروماتوگرافی بسيار اهميت دارد. زيرا اگر ستوني خوب پر نشود نمی تواند اجزا را خوب تفكيك كند. جسم پر شده بايستی همگن و یکنواخت باشد و در آن نباید هوای محبوس يا حباب بخار وجود داشته باشد.
تفکیک و جداسازی
در يك كروماتوگرافی ستونی ساده، روش کار به این صورت است که نمونه را در بالای ستون قرار می دهند و در طول تفكيك از یک حلال واحد استفاده مي كنند. اما معمولا از روشی كه به استخراج تدريجی (جز به جز) معروف است بهره می برند. در اين روش، جهت ظهور كروماتوگرام از يك مجموعه حلال استفاده می كنند. در این مجموعه، قطبيت حلال ها مرتب زیاد مي شود.
در حقیقت در شروع کار، با يك حلال غير قطبی (مانند هگزان) يك باند به سمت پايين ستون حركت می كند و از آن خارج می شود. در حالیکه باند های ديگر در نزديكی ابتدای ستون باقی مانده اند. حالا حلالی كه قطبيت آن اندكی بيشتر می باشد به ستون اضافه می شود. در حالت ايده آل اکنون بايد يك باند ديگر نیز خارج شود و همزمان بقيه باند ها در عقب آن باقی مانده باشند.
اگر قطبيت حلال به يكباره بالا برود، می تواند سبب شود تمام باند هايی كه باقي مانده اند يكباره و به شکل همزمان از ستون خارج شوند. از این جهت بايستی در هر مرحله قطبيت حلال را به میزان كم و با قاعده معين افزايش دهید. بهترين پیشنهاد اینست که از حلال های مخلوط استفاده کنید، زیرا تعويض كامل حلال چندان مناسب نمی باشد.
نکته
اگر ذرات مورد جداسازی رنگی باشند، کار تشخیص ساده می باشد. زیرا به راحتی می توانید باند هایی را که به سمت پایین ستون حرکت می کنند را مستقیما مشاهده نمایید. اما در مورد ذرات بی رنگ تغییرات را نمی توان به طور مستقیم مشاهده کرد. برای این ذرات، جهت مشاهده باندها از نور ماورای بنفش استفاده می شود. برای پیگیری جریان كروماتوگرافی، معمولا حجم های کوچک و ثابتی (به طور مثال ۲۵ میلی لیتر) از محلول استخراج شده را جدا می کنند. ابتدا حلال را تبخیر کرده تا ببینند ذره ای در آن وجود دارد یا خیر.
توجه داشته باشید که ممکنست یک ذره در چند ظرف مختلف پخش شده باشد. اما اگر حجم هر قسمت جدا شده را کم در نظر بگیرید، معمولا می توان باند های مختلف را در ظروف مختلف جمع آوری کرد. یک روش دیگر که برای پیگیری تفکیک مناسب اینست که محلول استخراج شده را در فاصله زمانی مختلف با تکنیک کروماتوگرافی لایه نازک مورد بررسی قرار دهید.
توجه داشته باشید که اجزای تفکیک شده را می توان مجددا به کمک دو روش زیر بدست آورد. عموما روش دوم کاربرد بیشتری دارد.
۱- مواد جامد ستون کروماتوگرافی را می توانید خارج کرده، قسمتی از آن که شامل باند مورد نظر است را جدا کرده و با حلال مناسب استخراج نمایید.
۲- از آنجاییکه باند ها در زمان های مختلفی خارج می شوند، می توان حلال را آنقدر از ستون کروماتوگرافی عبور دهید تا باند ها به طور کامل از انتهای آن خارج شده و در ظرف جداگانه ای جمع آوری نمایید.
کاربرد های کروماتوگرافی ستونی
کاربرد های این روش کروماتوگرفی را می توان به اختصار در دسته های زیر تقسیم کرد.
- آنالیز و تعیین کمی اجزای یک مخلوط
- تعیین ماهیت و خالص سازی ترکیبات مانند خالص سازی اسید های چرب
- جداسازی و تفکیک مولکول های زیستی مانند اسید های آمینه، پروتئین ها و کربو هیدرات
- جداسازی و تفکیک توکسین ها، ویتامین ها و هورمون ها
- تشخیص فساد مواد غذایی مانند شناسایی و کمی سازی فساد اسید پیرویک در شیر
- ارزیابی مشخصات اسید آلی در شیر و اندازه گیری لاکتوز آن
- شناسایی و اندازه گیری رنگدانه های مصنوعی و طبیعی
انواع کروماتوگرفی ستونی
کروماتوگرافی ستونی بسته به چگونگی جریان حلال در ستون کروماتوگرافی به دو دسته تقسیم می شود. اگر حلال با نیروی گرانش به پایین ستون حرکت کند، آن را، کروماتوگرافی ستونی گرانشی می نامند. اما اگر حلال با فشار مثبت هوا به پایین ستون حرکت کند به آن کروماتوگرافی فلاش می گویند. برای کروماتوگرافی گرانشی از ذرات بزرگتر (مقادیر پایین مش) و برای کروماتوگرافی فلاش از ذرات کوچکتر (مقادیر بیشتر مش) استفاده می شود. از طرفی دیگر، در روش کروماتوگرافی ستونی از دو نوع سیستم شویشی استفاده می کنند. سیستم شویشی در واقع استفاده از نسبت حلال های مختلف جهت جدا سازی است.
- سیستم شویشی ایزوکراتیک : در این نوع سیستم شویشی، از یک نسبت ثابت ترکیب حلال ها استفاده می کنند. در واقع از ابتدای جدا سازی تا انتهای آن، نسبت حلال ها تغییر نخواهد کرد.
- سیستم شویشی گرادیانی : در این سیستم شویشی، نسبت ترکیب حلال ها در طول زمان جداسازی تغییر می کند.
در سیستم شویشی ایزوکراتیک، زمان آنالیز طولانی می باشد و سبب پهن شدن پیک های مشاهده شده در کروماتوگرام خواهد شد. در حالیکه در شویش گرادیانی، جداسازی خوب با زمان آنالیز کوتاه دارید.
مقایسه کروماتوگرفی ستونی با کروماتوگرافی لایه نازک
مهمترین تفاوت این دو روش در نوع فاز ثابت استفاده شده می باشد. در کروماتوگرافی لایه نازک از ژل آلومینا یا سیلیکا به عنوان فاز ساکن استفاده می کنند. در حالیکه در کروماتوگرافی ستونی از یک ستون بسته بندی شده با مواد مناسب به عنوان فاز ساکن استفاده می کنند.
در روش ستونی، جذب سطحی متداول فرآیندی کند محسوب می شود که به مقادیر نسبتا زیادی از جاذب و نمونه نیاز می باشد. همچنین سیستم های مورد استفاده معمولا قیمت بالایی دارند و دستگاه مربوط به آنها ممکن است پیچیده باشد. در حالیکه در کروماتوگرافی لایه نازک به مقادیر بسیار کمی از جاذب و نمونه نیاز است و از طرفی، دستگاه ساده و ارزان خواهد بود.
در کروماتوگرافی لایه نازک معمولا جمع آوری اجزا نیاز نیست، اما در روش ستونی بایستی نمونه استخراج شده را در نهایت جمع آوری نمایید. مکانیسم های مورد استفاده برای جداسازی در کروماتوگرافی لایه نازک بر اساس جذب جامد- مایع می باشد، در حالیکه در روش ستونی، بر اساس اندازه، بار و شکل ذرات است.
