کروماتوگرافی کاغذی (Paper Chromatography) با نام متداول و اختصاری پی سی (PC) یکی از روش های کروماتوگرافی می باشد که به کمک فاز ساکن (نوار کاغذی) جهت جداسازی مولکول ها و ترکیبات موجود در یک محلول کاربرد دارد. در مقالات پیشین نشریه جهان شیمی فیزیک، درباره آنالیز کروماتوگرافی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، گاز کروماتوگرافی و کروماتوگرافی لایه نازک مطالبی را مطرح کرده ایم. در این مقاله به معرفی کروماتوگرافی کاغذی، انواع و کاربرد های آن در آزمایشگاه پرداخته می شود. در ادامه با ما همراه باشید.
کروماتوگرافی کاغذی چیست
کروماتوگرافی کاغذی از انواع روش های جدا سازی مواد می باشد که در آن، از یک کاغذ به عنوان فاز ساکن بهره می برند. این جداسازی در واقع بر اساس سرعت های متفاوت حرکت مواد در طول کاغذ انجام می شود. از این نوع کروماتوگرافی معمولا جهت جداسازی ذرات رنگی و یا قابل رنگ شدن در محلول مورد نظر استفاده می کنند. در این تکنیک، فاز ثابت در حقیقت یک کاغذ جاذب (مانند کاغذ واتمن) می باشد. از طرفی دیگر، فاز متحرک یک محلول متشکل از چند نوع مختلف حلال می باشد. کرماتوگرافی PC معمولا در تمام آزمایشگاه های شیمی به عنوان یک ابزار ارزان قیمت و راحت جهت تفکیک و جداسازی مواد شیمیایی از یکدیگر محسوب می شود.
نحوه عملکرد کروماتوگرافی کاغذی نیز مثل سایر روش های کروماتوگرافی می باشد. بدین صورت که اجزای فاز متحرک (حلال هایی مانند آب، روغن یا ایزوپروپیل الکل) جذب نوار کاغذی می شوند. همزمان با حرکت حلال بر روی فاز ساکن، حلال مورد نظر بخشی از محتویات آنالیت را نیز با خود بر روی کاغذ به بالا می برد. این جابجایی به صورتی است که ذرات با چسبندگی بیشتر به کاغذ، نسبت به ذرات با چسبندگی کمتر به آن، آهسته تر حرکت می کنند.
به بیان دیگر، مولکول های مختلف با سرعت های متفاوت بر روی کاغذ کروماتوگرافی بالا می روند، در نتیجه اجزای مختلف محلول از یکدیگر جدا می گردند. با اتمام فرآیند تفکیک و جداسازی، هر کدام از ذرات مخلوط مورد نظر به صورت نقطه ای (لکه ای) در سطوح مختلف کاغذ کروماتوگرافی ظاهر می گردند. در واقع، هدف این کروماتوگرافی نیز بدست آوردن نقاطی است که به خوبی از هم جدا شده باشند.
اساس کروماتوگرافی کاغذی
این تکنیک عموما به عنوان سیستم تقسیمی در نظر گرفته می شود. در این نوع کروماتوگرافی، فاز ساکن آب می باشد که به وسیله جذب سطحی بر روی مولکول های سلولز قرار گرفته است. خود مولکول های سلولز نیز به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیت ثابت نگه داشته شده اند. به بیان دیگر، اساس کروماتوگرافی کاغذی را می توان حاوی اصول کروماتوگرافی تقسیمی و کروماتوگرافی جذب سطحی دانست، زیرا در واقع مواد بین فاز های مایع تقسیم و یا توزیع می گردند. این نوع کروماتوگرافی را می توان به عنوان روشی ساده در تجزیه و تحلیل کیفی به حساب آورد. این روش برای آنالیز نمونه های ساده ای مانند جوهر ها و رنگ گیاهان بکار می رود.
فاکتور بازداری
همانند سایر روش های کروماتوگرافی، هر نقطه در کروماتوگرافی PC نیز دارای یک فاکتور بازداری (Rf)، فاکتور تاخیر یا ضریب بازداری می باشد. این فاکتور برابر با مسافت طی شده به وسیله ذره مورد نظر تقسیم بر فاصله طی شده به وسیله حلال خواهد بود. با توجه به معنای فاکتور بازداری، این ضریب خاصیت مشخصی از ترکیب می باشد. جهت شناسایی یک ترکیب مجهول، می توان فاکتور بازداری ترکیب مورد نظر را با فاکتور بازداری ترکیبی مشخص که در شرایط یکسان کروماتوگرافی شده است، مقایسه نمود و در نهایت ترکیب را شناسایی کرد.
با توجه به تعریف فاکتور بازداری مشخص است که هر چه ذره کمتر جذب فاز ثابت شود، سریع تر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می کند. از این رو، ضریب بزرگتری نیز خواهد داشت. مقادیر فاکتور بازداری می تواند تحت تاثیر عوامل مختلفی همچون نوع حلال، دما، نوع کاغذ، ضخامت فاز ثابت، رطوبت فاز ساکن و رطوبت فاز متحرک قرار بگیرد.
مراحل کروماتوگرافی کاغذی
در کروماتوگرافی کاغذی تک بعدی، کاغذ به شکل نوار هایی در عرض ۵ سانتی متر و طول ۲۰ سانتی متر بریده می شوند. در حالیکه در PC دو بعدی، از ورق های ۲۰ × ۲۰ سانتی متر استفاده می کنند. در فاصله ۰.۵ تا ۱ سانتی متری انتهای کروماتوگرام، یک خط با مداد می کشند. نمونه حل شده در یک حلال فرار را به شکل یک قطره یا لکه و به وسیله یک سرنگ یا میکروپیپت بر روی کاغذ قرار می دهند. جهت جلوگیری از پخش شدن، قطر لکه مورد نظر نباید بیشتر از دو میلی متر باشد. توجه داشته باشید که مقدار نمونه حتما بین ۱۰ تا ۵۰ میکرو گرم باشد، این مقدار نبایستی بیشتر از ۵۰۰ میکرو گرم انتخاب شود.
لازم به ذکر است که چند نمونه را نیز می توانید به شکل لکه های مجزا در طول یک خط در پایین کاغذ لکه گذاری کنید. اغلب از یک سشوار جهت تبخیر حلال استفاده می کنند. اگر نمونه خیلی رقیق باشد، می توانید چند لکه را روی هم قرار دهید تا به غلظت مناسب برسد. فقط توجه داشته باشید که در فاصله هر لکه گذاری، حلال باید تبخیر گردد.
حال صفحه خشک شده را تا حد امکان به صورت صاف و ایستاده در شیشه حلال (تانک کروماتوگرافی) قرار دهید. اگر درب تانک محکم باشد، هوا در آن نفوذ نمی کند، بنابراین کاغذ و بخار حلال با یکدیگر به تعادل می رسند. لازم به ذکر است که میزان حلال موجود در ظرف، بایستی حتما پایین تر از خط کشیده شده در انتهای کروماتوگرام باشد. حلال با خاصیت موئینگی به سمت بالا حرکت می کند و همزمان نمونه ها را با خود جابجا می کند. قطعا میزان جابجایی لکه ها به وسیله حلال وابسته به میزان انحلال نمونه ها در حلال است.
نکته
پس از تفکیک، مرز پیشروی حلال را علامت گذاری کرده و صفحه را خشک نمایید. الان می توانید ترکیبات جدا شده را به وسیله روش های شیمیایی و یا فیزیکی شناسایی کنید. اگر ذرات رنگی باشند، کار تشخیص بسیار ساده می باشد. در صورتیکه لکه نامرئی بود، می توانید به کمک یک وسیله پاشنده، یک محلول شناساگر مناسب را بر روی صفحه اسپری نمایید تا اجزا نمونه به ذرات رنگی تبدیل شوند. برای انواع مختلف ترکیبات، تعداد زیادی از چنین شناساگرهایی داریم. اگر ترکیب، دارای خاصیت فلوئورسانس باشد، می توانید از یک اشعه ماورا بنفش کمک بگیرید. علاوه بر آن، ترکیبات نشان دار یا رادیواکتیو را نیز می توان با استفاده از یک شمارنده تابش تشخیص داد.
کاربرد های کروماتوگرفی کاغذی
کاربرد های بسیار زیادی را می توان برای روش کروماتوگرفی کاغذی در نظر گرفت. از جمله این کاربرد ها، می توان به اختصار به موارد زیر اشاره کرد.
- جدا سازی مخلوط های مواد آلی
- جدا سازی یون های معدنی (آنیون ها و کاتیون ها)
- جدا سازی های مواد با ماهیت زیستی
- مطالعه و بررسی فرآیند تخمیر
- کنترل خلوص مواد دارویی و تعیین مقدار دارو در بدن انسان ها و حیوانات
- جدا سازی اسید های آمینه و پپتید ها در مطالعه و بررسی ساختار های پروتئین ها
- بررسی ترکیبات لوازم آرایشی و بهداشتی
- بررسی آلودگی های موجود در آشامیدنی ها و خوردنی ها
- بررسی مخلوط واکنش در آزمایشگاه های زیستی و بیوشیمی
- آزمایش روزمره ادرار و دیگر مایعات بدن برای سنجش اسید آمینه و قند
- جدا سازی و تفکیک باز های پورین و نوکلئوتید ها در آزمایش اسید های نوکلئیک
- جداسازی استرئید ها، جداسازی آلکالوئید ها
- تجزیه عمومی و تجزیه بسپارها
- تشخیص و ارزیابی فلزات موجود در خاک ها و نمونه های زمین شناسی
- بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی
- جدا سازی ترکیبات نشان دار به وسیله رادیو ایزوتوپ ها
لازم به ذکر است که تکنیک کروماتوگرفی کاغذی جهت جداسازی و تفکیک مواد فرار غیر فعال همچون هیدروکربن ها و همچنین جداسازی اسید های چرب با فراریت بالا مناسب نیست.
انواع کروماتوگرفی کاغذی
- کروماتوگرافی کاغذی صعودی یا بالارونده : در این تکنیک، همانطور که از نامش مشخص است، حلال در جهت بالا حرکت می کند.
- کروماتوگرافی کاغذی نزولی : در این تکنیک، همانطور که از نامش مشخص است، جهت حرکت حلال به خاطر گرانش و خاصیت مویینگی به سمت پایین می باشد.
- کروماتوگرافی کاغذی شعاعی: در این تکنیک، نمونه در مرکز یک کاغذ صافی دایره ای شکل قرار می گیرد. با خشک شدن نمونهبر روی کاغذ، کاغذ کروماتوگرافی را به صورت افقی درون یک پتری دیش حاوی حلال می گذارند.
- کروماتوگرافی کاغذی دو طرفه: این تکنیک بیشتر برای نمونه هایی کاربرد دارد که مقدار فاکتور بازداری در آن نمونه ها بسیار نزدیک به یکدیگر باشد.
معایب کروماتوگرافی کاغذی
- ایجاد لکه های چند تایی : معمولا در کروماتوگرافی یون های فلزی، اگر محلول اولیه دارای آنیون های متفاوت از آنیون موجود در محلول باشد، در این صورت رقابتی بین آنیون ها برای واکنش با یون فلزی بوجود می آید. در نتیجه دو لکه ظاهر می شود که هر یک از آن دو، مربوط به یکی از نمک های فلزی خواهد بود. یا حتی ممکنست که یون فلزی دو کمپلکس متفاوت با حلال ایجاد نماید.
- دنباله دار شدن لکه ها : اگر مقدار ذره مورد نظر به مقدار زیادی بر روی کاغذ کروماتوگرافی قرار داده شود و یا اینکه سرعت حرکت حلال متفاوت باشد، در این حالت ذره نمی تواند برای ایجاد یک لکه مجزا و تک به تعادل برسد. در نتیجه در سطح بزرگی از کاغذ کروماتوگرافی پخش می شود.
- مشکلات مربوط به اثرات لبه یا کناره : اگر لکه ها خیلی نزدیک به کناره نوار قرار داده شوند، احتمال دارد در امتداد کنار کاغذ پخش شوند. در این صورت عمل نفوذ می تواند به سبب بالا بودن غلظت فاز متحرک در آن ناحیه و یا به دلیل بالاتر بودن سرعت تبخیر حلال در کنار کاغذ کروماتوگرافی، باعث ایجاد اثرات تقسیمی غیر عادی شوند.
مقایسه کروماتوگرافی لایه نازک با کروماتوگرافی کاغذی
- تفاوت در فاز ساکن: در کروماتوگرافی لایه نازک، فاز ساکن معمولا صفحات شیشه ای پوشیده شده با سیلیکاژل و یا آلومینا است. در حالیکه در کروماتوگرافی کاغذی از کاغذ های سلولزی بهره می برند که شامل آب در منافذ خود می باشند. پس در حقیقت در TLC فاز ساکن سیلیکاژل یا آلومینا و در PC مولکول های آب اند.
- مکانیسم تفکیک و جدا سازی: با اینکه هر دو روش از روش های کروماتوگرافی جامد – مایع حساب می شوند، اما در کروماتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی از نوع جذب سطحی و کروماگرافی کاغذی یک کروماتوگرافی تقسیمی می باشد.
- تکنیک لایه نازک دارای سرعت بیشتر نسبت به تکنیک کاغذی خواهد بود. همچنین در بیشتر موارد، تفکیک و جداسازی مواد بهتر صورت می گیرد.
به طور کلی می توان گفت که روش کروماتوگرفی کاغذی ارزان تر می باشد و زمان جداسازی کمتری نیز دارد. این تکنیک جدا سازی بیشتر برای جدا سازی ترکیبات قطبی و یا محلول در آب کاربرد دارد. از آنجاییکه کاغذ به ترکیبات خورنده حساس می باشد، پس این ترکیبات نباید در نمونه مورد نظر وجود داشته باشند. از طرفی دیگر، هزینه آنالیزی در کروماتوگرافی لایه نازک بالاتر است و زمان تفکیک و آنالیز با آن طولانی تر خواهد بود. همچنین، صفحاتTLC را می توان برای تفکیک بهتر در آون حرارت داد. این صفحات به مواد خورنده حساسیت زیادی ندارند و بیشتر برای ترکیبات با قطبیت کم استفاده می شوند.
