کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography) با نام متداول و اختصاری تی ال سی (TLC) یکی از روش های کروماتوگرافی می باشد که به کمک فاز ساکن جهت جداسازی مخلوط ها کاربرد دارد. کروماتوگرافی لایه نازک در واقع یک روش جداسازی ساده، حساس، انعطاف پذیر و با هزینه ای پایین جهت تجزیه و تحلیل کمی و کیفی مقادیر بسیار کم مواد، در آزمایشگاه می باشد. در مقالات پیشین نشریه جهان شیمی فیزیک، درباره آنالیز کروماتوگرافی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و گاز کروماتوگرافی مطالبی را مطرح کرده ایم. در این مقاله به معرفی کروماتوگرافی لایه نازک، انواع و کاربرد های آن در آزمایشگاه پرداخته می شود. در ادامه با ما همراه باشید.
کروماتوگرافی لایه نازک چیست
کروماتوگرافی TLC از انواع کروماتوگرافی های جذب سطحی می باشد که در آن، از صفحات با ضخامت نازک استفاده می گردد. در این روش کروماتوگرافی جهت جدا کردن اجزای یک مخلوط، از یک فاز ثابت نازک که روی یک بستر بی اثر (مانند صفحه شیشه ای، پلاستیکی، پلی استر یا ورق آلومینیوم) قرار گرفته است، استفاده می گردد. در حقیقت موقعیت و جایگاه اجزای جدا شده بر روی صفحه مشخص می شود. دستگاه کرماتوگرافی لایه نازک معمولا در تمام آزمایشگاه های شیمی به عنوان یک ابزار مناسب، ساده، ارزان و راحت جهت تفکیک و جداسازی سریع و ساده مواد شیمیایی وجود دارد.
نحوه عمل کروماتوگرافی لایه نازک نیز همانند سایر تکنیک های کروماتوگرافی می باشد. بدین صورت که اجزای فاز متحرک (حلال) بر روی سطحی از فاز ساکن حرکت می کنند. این حرکت به صورتی است که ذرات با چسبندگی (تمایل جذب) بیشتر، نسبت به ذرات با چسبندگی کمتر، آهسته تر حرکت نموده و در اثر تفاوت سرعت حرکت آنها، جداسازی انجام می شود. با اتمام فرآیند جداسازی، هر کدام از ذرات مخلوط به صورت نقطه ای (لکه ای) در سطوح مختلف در پلیت کروماتوگرافی ظاهر می گردند. پس از آن، مشخصه های ذرات و طبیعت آنها بررسی می شوند. در واقع، هدف این کروماتوگرافی بدست آوردن نقاطی است که به خوبی از هم جدا شده باشند.
اساس و مفاهیم پایه کروماتوگرافی لایه نازک
این کروماتوگرافی بر اساس اجزا، به شرح زیر می باشد.
- جاذب های مناسب (فاز ساکن یا صفحه کروماتوگرافی) که به صورت یک لایه نازک بر روی یک تکیه گاه مناسب پوشانده شده است.
- حلال ها یا مخلوط های حلال به عنوان فاز متحرک یا فاز شوینده
- مولکول های نمونه یا آنالیت
صفحات (فاز ثابت یا فاز ساکن)
صفحات (پلیت ها) را هم می توان در آزمایشگاه تهیه نمود و هم اینکه به صورت تجاری تهیه و خریداری کرد. آلومینا و سیلیکاژل از جمله رایج ترین فاز های ثابت محسوب می شوند، در حالیکه سایر موارد نیز در دسترس می باشند. در حقیقت در این تکنیک، یک لایه نازک و یکنواخت از سیلیکا ژل و یا آلومینا را بر روی یک قطعه شیشه ای، فلزی یا پلاستیکی، پوشش می دهند.
توجه داشته باشید که برای تشخیص نقطه ها، بسیاری از این صفحات را آغشته به ترکیبی که تحت اشعه ماوراء بنفش موج کوتاه (۲۵۴ نانومتر) فلورسانس می نمایند. همانطور که بیان شد، بستر بی اثر این صفحات معمولا از جنس شیشه، آلومینیوم یا پلاستیک هستند. لازم به ذکر است که در هنگام انتخاب فاز ساکن، در ابتدا بایستی خواص نمونه را در نظر گرفت.
فاز متحرک (حلال)
می توان گفت که انتخاب صحیح و مناسب فاز متحرک، مهم ترین بخش کروماتوگرافی TLC خواهد بود. برای این انتخاب، نیاز به کمی آزمایش و خطا می باشد. لازم به ذکر است که مثل مرحله انتخاب فاز ثابت، در انتخاب حلال نیز باید خواص شیمیایی آنالیت را در نظر گرفت.
به طور کلی، اگر یک ذره از آنالیت مورد بررسی در یک حلال معین نا محلول باشد، در حالیکه یکی دیگر از ذرات آن نمونه، به خوبی در حلال حل شود، جداسازی های خوبی خواهید داشت. به این صورت که اگر ذره مورد نظر در فاز متحرک محلول باشد، روی صفحه TLC حرکت کرده و بالا می رود. اما اگر به فاز ساکن متمایل باشد و به آن بچسبد، پس خیلی بر روی کروماتوگرام حرکت نمی کند.
توجه داشته باشید که اگر آنالیت مورد نظر، مولکول آلی غیر قطبی باشد (مولکولی بدون گروه های عاملی و فقط شامل اتم های کربن و هیدروژن مانند نفتالین) می توان با حلال های پنتان خالص یا هگزان شروع کرد. اما اگر آنالیت مورد نظر شامل یک یا دو گروه عاملی با قطبیت متوسط ( مانند گروه های اتری، کتونی، استری و …) باشد، با حلال مخلوط ۴: ۱ هگزان/ اتیل استات کار کنید. به طور کلی کی توان جلال ها را به دسته زیر تقسیم کرد.
- حلال‌هایی با قطبیت بالا مانند متانول و دی کلرومتان
- حلال‌هایی با قطبیت متوسط مانند دی اتیل استات
- حلال‌هایی با قطبیت پایین مانند هگزان و دی اتیل اتر
بهتر است بدانید
ذکر این نکته حائز اهمیت است که اسید ها، باز ها و یا ترکیباتی با قطبیت زیاد، در حلال های خنثی معمولا به جای نقطه یک نوار را نشان می دهند. در این حالت می توان برای اصلاح نتایج از چند درصد اسید استیک یا اسید فرمیک به حلال (برای نوار حاصل از اسید ها)، چند درصد تری اتیل آمین (برای نوار حاصل از باز ها) و چند درصد متانول (برای نوار حاصل از ترکیبات قطبی) اضافه کرد.
فاکتور بازداری
لازم به ذکر است که هر نقطه در کروماتوگرافی TLC دارای یک فاکتور بازداری (Rf) یا ضریب بازداری می باشد. این ضریب برابر با فاصله طی شده توسط جز مورد نظر تقسیم بر فاصله طی شده توسط حلال خواهد بود. با توجه به معنای فاکتور بازداری، ملاک شناسایی کیفی هر ترکیب (در شرایط مشخص)، در کروماتوگرافی لایه نازک، مسافت طی شده توسط هر نقطه از نقطه شروع است.
با توجه به تعریف مشخص می شود که هرچه ذره، کمتر جذب فاز ساکن شود، سریعتر حرکت کرده و مسیر بیشتری را طی می کند، پس فاکتور بازداری بزرگتری دارد. مقادیر ضریب بازداری ممکن است تحت تاثیر عوامل مختلفی نظیر ضخامت لایه ساکن، رطوبت روی صفحه TLC، اشباع بودن یا نبودن تانک TLC، عمق فاز متحرک، دما، ماهیت صفحه TLC، اندازه نمونه و پارامتر های حلال قرار بگیرد.
محفظه یا تانک TLC
جهت حرکت حلال بر روی صفحه کروماتوگرافی به یک اتاقک یا محفظه (تانک) نیاز دارید. در واقع یک ظرف شیشه ای با دهانه پهن مناسب خواهد بود. این محفظه باید حاوی میزان حلال کافی باشد به صورتیکه کف آن را کامل حلال بپوشاند. همچنین می توان از یک تیکه کاغذ صافی یا سایر مواد جاذب برای کمک کردن به اشباع محیط اتاقک با بخارات حلال نیز استفاده نمود. توجه داشته باشید که جهت به حداقل رساندن تبخیر حلال، بایستی یک درب یا پوشش بر روی اتاقک قرار داد.
مراحل کروماتوگرافی لایه نازک
در ابتدا نیاز است تا صفحات کروماتوگرافی یا کروماتوگرام تهیه شوند. برای اینکار جاذب به صورت یک لایه نازک و با ضخامت یکنواخت بر روی یک تکیه گاه سفت و بی اثر پخش می شود. جاذب های جامد را می توان به صورت پودر ریز با آب و یا یک مایع فرار به شکل خمیر در آورند. همچنین می توان با استفاده از روش های پاشیدن یا فرو بردن نیز کروماتوگرام را تهیه نمود. برای این کار از دست و یا تجهیزات مخصوص کروماتوگرافی لایه نازک استفاده می کنند.
در قدم بعدی صفحه را به اندازه صحیح برش داده و در فاصله ۰.۵ تا ۱ سانتی متری انتهای کروماتوگرام، یک خط با مداد کشیده شود. حال نمونه را که در یک حلال مناسب حل کرده اند، به میزان کافی بر روی خط قرار دهید و محل های نمونه گذاری را با شماره مشخص نمایید. به بیان دیگر، مهمترین مرحله کروماتوگرافی لایه نازک (مخصوصا در آنالیز های کمی)، نمونه گذاری می باشد. توجه داشته باشید که انتخاب تکنیک نمونه گذاری به دقت مورد نیاز، حجم نمونه، تعداد آنالیز ها و درجه کنترل خودکار مورد نظر بستگی دارد. لکه ها را معمولا با استفاده از پیپت های شیشه ای بسیار نازک (لوله های کاپیلاری یا موئین) بر روی صفحه قرار می گیرند. بهتر است که لوله موئین به اندازه کافی نازک باشد تا نقطه هایی مرتب داشته باشید.
نکته
بعد از هر لکه گذاری جهت تبخیر حلال، صفحه را خشک نمایید. سپس صفحه خشک شده را تا حد امکان به صورت صاف در شیشه حلال قرار دهید. توجه داشته باشید که میزان حلال ریخته شده در ظرف، بایستی پایین تر از خط کشیده شده در انتهای کروماتوگرام باشد. حلال با خاصیت موئینگی به سمت بالا حرکت می کند و در حین حرکت خود، نمونه ها را (که به شکل لکه هایی بر روی خط قرار گرفته اند) حرکت می دهد. میزان جا به جایی لکه ها به وسیله حلال بستگی به میزان انحلال نمونه ها در حلال دارد.
در صورتی که لکه نامرئی بود، می توانید از یک اشعه ماوراء بنفش کمک بگیرید. در این حالت بایستی لکه بنفش رنگ دیده شود. اگر لکه قابل رویت نبود، باید از نمونه بیشتری در صفحه گذاشته شود. لازم به ذکر است که هرگز نباید اجازه داد که حلال تا انتهای صفحه حرکت کند. در زمان مناسب، صفحه را برداشته و سپس بلافاصله با مداد یک خط دیگر در قسمت جلوی حلال رسم کنید. لازم به ذکر است که این کار باید بلافاصله و سریع انجام شود، چون ممکنست حتی بعد از خروج صفحه، باز هم حلال به حرکت خود ادامه دهد.
اگر ذرات مورد جداسازی رنگی باشند، کار تشخیص بسیار ساده می باشد. برای لکه های نامرئی دوباره با استفاده از اشعه ماوراء بنفش، دایره ای به کمک مداد در اطراف لکه های تشکیل شده بکشید. در صورتیکه ذرات نسبت به اشعه ماوراء بنفش فعال نباشند، می توان از تعدادی ترکیبات شیمیایی (ترکیبات عمومی و یا مختص یک مولکول یک گروه خاص) برای ایجاد لکه های رنگی مربوط به اجزا جدا شده بر روی کروماتوگرام استفاده کرد.
کاربرد ها و جنبه های جدید کروماتوگرافی لایه نازک
- توانایی آنالیز و تفکیک تعداد زیادی نمونه در مدت زمان کوتاه
- بعد از اتمام جداسازی، می توان داده های بدست آمده را برای مدت زمان طولانی ذخیره نمود. همچنین اجزا جدا شده را می توان به وسیله روش های تجزیه ای دیگر نظیر طیف سنجی زیر قرمز، طیف سنجی جرمی و غیره، مورد آنالیز قرار داد
- بررسی خلوص ترکیبات، آنالیز مخلوط ترکیبات پیچیده (نظیر نمونه های گیاهی، محیط زیست یا پزشکی قانونی)، بررسی و آنالیز مخلوط های واکنش در طی فرآیند سنتز ترکیبات مختلف
- کاربرد های بالینی نظیر آزمایشات غربالگری، مطالعات متابولیسم، غربالگری دارو و کنترل دوپینگ، آنالیز بیوشیمیایی (جهت جداسازی، مقایسه، مشخص کردن ترکیبات و متابولیت ها در خون، سرم، مایعات بدن و ادرار)
- کاربرد در صنایع غذایی نظیر کنترل کیفیت غذا، کنترل مواد افزودنی، مواد شیرین کننده، آفت کش ها و آزمایش ثبات یا انقضا
- کاربرد در صنایع آرایشی نظیر جداسازی و شناسایی اجزای متنوع رنگ های مختلف محصولات آرایشی- بهداشتی، شناسایی مواد رنگ آمیزی و نگهدارنده از سایر مواد و تشخیص مواد غیر مجاز
- کاربرد در صنایع دارویی نظیر تشخیص دارو در مایعات بدن، نظارت بر خلوص دارو، تشخیص باقیمانده دارو در غذا، تشخیص متابولیت های دارو، کنترل کیفیت دارو
- کاربرد در پزشکی قانونی مانند تشخیص جعل مدرک، بررسی مسمومیت و آنالیز مواد رنگی
- کاربرد در محیط زیست نظیر توانایی آنالیز آب، خاک و پسماند ها
- با تغییر ساده فاز های متحرک و ساکن، بهینه سازی فرآیند جداسازی بسیار مقرون به صرفه و سریع خواهد بود
انواع کروماتوگرفی لایه نازک
کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا
كروماتوگرافي لايه نازك با عملكرد بالا (High-performance thin-layer chromatography) که به اختصار HPTLC نامیده می شود، شکل بهبود يافته كروماتوگرافي لايه نازك است. در این تکنیک، با انجام خودكار مراحل كروماتوگرافي سبب افزايش جداسازی و همچنین اندازه گيری كيفی و كمی با دقت حساسیت، کارایی و صحت بالاتری می شود.
کروماتوگرافی لایه نازک- اسپکترومتر جرمی TLC-MS
اتصال دستگاه TLC به یک طیف سنج جرمی باعث ایجاد زمینه های کاربردی جدیدی برای کروماتوگرافی مسطح می شود. سیستم های کروماتوگرافی لایه نازک – اسپکترومتر جرمی به دو دسته آنالیز جرمی مستقیم (با نمونه برداری مستقیم از سطح کروماتوگرام در کمتر از یک دقیقه و انتقال به طیف سنج جرمی) و آنالیز جرمی غیر مستقیم (بعد از مراحل جداسازی و نفکیک به وسیله TLC، نمونه از روی کروماتوگرام تراشیده، استخراج، خالص سازی می شود و نهایتا به دستگاه طیف سنج جرمی تزریق می گردد) تقسیم می شوند.
