کشت باکتری (کشت میکروبی) چیست؟ – انواع و چگونگی کشت

یکی از روش های تحقیق در زیست شناسی مولکولی روش کشت باکتری (کشت میکروبی) می باشد که در این روش باکتری ها در محیط کشت آزمایشگاهی و با روش های کنترل شده تکثیر و رشد داده می شوند. از این شیوه در روش های آزمایشگاهی علوم پزشکی و طبی نیز استفاده می شود. در کتاب علوم پایه هشتم به محیط کشت و روش کشت میکروبی اشاره شده است. برای درک و شناخت کشت باکتری و انواع روش های آن ما را با این مقاله نشریه جهان شیمی فیزیک همراهی کنید.

کشت باکتری چیست

کشت باکتری یکی از روش های مهم در میکروبیولوژی می باشد که در آن با آماده سازی یک محیط کشت مناسب از نظر مواد مغذی میکروب ها، رشد داده می شوند. با استفاده از کشت میکروب ها در یک محیط کشت مناسب، می توان نوع و مقدار آن در یک نمونه آزمایشگاهی تعیین کرد. به عنوان نمونه وقتی یک نمونه ای از گلو برای آزمایش برداشته می شود، از لحاظ وجود میکروارگانیسم های ایجاد کننده استرپتوکوک در یک محیط کشت خاص مورد آزمایش قرار می گیرد. وقتی یک باکتری خاص شناسایی می شود باید یک محیط کشت خالص برای رشد آن فراهم شود.

ضرورت کشت باکتری

٭ با انجام آزمایش های میکروسکوپی باکتری ها را نمی توان از هم تشخیص داد بنابراین با کشت نمونه های بالینی و انجام آزمایش های بیوشیمیایی و سرولوژیک می توان شناسایی باکتری ها را انجام داد.

٭ با شناسایی میکروب یا عاملی که باعث ایجاد بیماری های عفونی شده می توان مقاومت و همچنین حساسیت آن ها را در برابر داروهایی که برای درمان آن ها تجویز می شود را تعیین کرد.

٭ با کشت میکروب ها و تهیه ی آنتی ژن از آن ها، می توان بیماری های عفونی را در آزمایش های سرمی تشخیص داد.

٭ با کشت باکتری ها می توان سرم و واکسن از آن ها تهیه کرد.

٭ همچنین برای ساخت آنتی بیوتیک ها و فرآورده های بیولوژیکی از باکتری ها، آن ها کشت داده می شوند.

نکته :

کشت میکروب ها باید در هود باکتریولوژی، کنار شعله و جایی باشد که هوا در آن جا جریان نداشته باشد تا محیط کشت و رشد باکتری ها توسط میکروب های هوا آلوده نشود.

مواد و ابزار مورد نیاز برای کشت باکتری ها

ابزار کشت

برای برداشت میکروب ها با توجه به نوع محل آن ها از سه وسیله استفاده می شود. یکی از این وسیله ها میله پلاتینی می باشد. انتهای این میله ها پلاتینی با یک سمت آلومینیومی قرار گرفته در عایق می باشد. این انتها می تواند دارای دو شکل باشد. یک شکل از این وسیله به طور میله ی بدون انحنا بوده و برای نمونه های با مقدار کم و کشت عمقی از آن استفاده می شود. در شکل دیگر که لوب نیز نامیده می شود و دارای حلقه ۲ تا ۴ میلی متری است می توان مقداری نمونه ی جامد یا قطره ای از نمونه مایع را برداشت. در ساخت این وسیله گاه به جای پلاتین از نیکروم استفاده می شود.

ابزار دیگری که برای برداشت نمونه از آن استفاده می شود سیم یا چوب باریک با انتهای پنبه هیدروفیلی بوده که بعد از استریل کردن به کار گرفته می شود و سواب نام دارد. بعد از استفاده آن را سوزانده و در ماده ضدعفونی نگه می دارند. وسیله ی سوم برای برداشتن نمونه های مایع بوده و پی پت پاستور نام دارد و در محلول های ضدعفونی نگه داری می شود.

محیط کشت

برای رشد میکروارگانیسم ها به مواد مغذی و مکمل های خاصی نیاز است که محیطی که از لحاظ مواد معدنی و آلی، آب و غذا، اکسیژن، اسیدیته و نوع بستر برای رشد میکروب ها در محیط آزمایشگاه، آماده شود را محیط کشت می گویند. در رشد بعضی از باکتری ها در محیط های کشت، باید مواد دیگری چون ویتامین ها نیز به آن ها اضافه شوند. محیط کشت می تواند طبیعی و داخل سلول های بدن باشد و یا توسط خود محققان در شرایط آزمایشگاه آماده شود و مصنوعی باشد. یکی از بهترین محیط های کشت، خون می باشد که ملزومات لازم برای رشد میکروب ها چون اکسیژن، دمای مورد نیاز، PH مناسب و مواد مغذی را دارد. یک محیط کشت برای رشد تمام باکتری ها مناسب نیست و باکتری های مختلف از لحاظ نیاز به مواد غذایی، متفاوت هستند.

شعله

برای این که در محیط کار و آزمایشگاه ها همیشه آلودگی هایی وجود دارد، کشت دادن میکروب ها باید در فاصله ۱۰ تا ۱۵ سانتی متری از شعله انجام شود.

انکوباتور یا اتوو (گرم خانه)

همان طور که گفته شده کشت باکتری ها باید در شرایط مساعدی از دما، اکسیژن و رطوبت انجام شود. به منظور فراهم کردن این شرایط از دستگاهی به نام انکوباتور استفاده می شود که می توان با ترموستات آن دمای محیط را تنظیم کرده و با قطع و اتصال جریان برق، دمای ثابت را حفظ کرد. درجه حرارت کشت میکروب های بیماری را ۳۵ تا ۳۸ درجه سانتی گراد می باشد، اما گاهی به دمای ۲۲ درجه سانتی گراد برای کشت نیاز است که در این هنگام ملزومات جوی در نظر گرفته می شود.

انواع روش های کشت باکتری

کشت در محیط جامد داخل لوله

برای کشت خالص باکتری از لوله استفاده می کنیم. در این روش ابتدا بعد از استریل کردن لوله پلاتینی، از همان انتهای پلاتینی روی شعله می گیریم تا سرخ شود. همچنین دسته فلزی آن را با عبور از روی شعله استریل می کنیم. بعد پنبه روی لوله را با انگشت کوچک حلقه کرده روی کف دست، بر می داریم، هوای داخل لوله را بلافاصله با عبور دهانه لوله از روی شعله، گرم می کنیم تا آلوده نشود. بعد از استریل وقتی حلقه پلاتین سرد شد، با وارد کردن داخل لوله می توان مقداری میکروب را خارج کرده و آن را در محیط مورد نظر کشت می دهیم. برای وارد کردن این نمونه داخل لوله کشت، از انتهای یک سانتی متری انتهای لوله، خط هایی با میله پلاتینی حاوی باکتری روی تمام سطح ژلوز کشیده می شود. پنبه ی آن را بعد از عبور سر لوله از شعله، می گذاریم.

بعد از تمام این مراحل محیط محیط کشت را داخل انکوباتور می گذاریم.

حلقه پلاتین آلوده به باکتری، برای جلوگیری از پراکنده شدن به اطراف قبل از استریل کامل شدن، باید به تدریج به شعله نزدیک شود.

کشت به روش عمقی در محیط جامد ایستاده و شیبدار در لوله

در این روش به حالت مذاب محیط کشت جامد (آگاردار) را داخل لوله ریخته و با قرار دادن در حالت سرد می شود و بعد از آغشته کردن میله پلاتینی نیزه ای شکل به باکتری، آن را در محیط کشت به طور عمقی فرو برده و بدون تغییر آن را خارج می کنند و داخل انکوباتور می گذارند. در محیط های کشت شیبدار، قبل از سرد شدن، محیط های کشت جامد به حالت شیبدار قرار داده می شوند و بعد از سرد شدن میله آغشته به باکتری را با حفظ شرایط تعادل، به طور مستقیم داخل بخش عمودی کرده و قبل از خارج کردن، روی سطح شیبدار مارپیچی می کشند.

کشت خطی در پلیت

در این روش ابتدا مقداری از باکتری را با استفاده از یک آنس استریل شده روی محیط پیش ریخته به شکل خط های موازی می کشند. با تقسیم کردن پلیت به چهار قسمت و کشیدن آنس آغشته به باکتری در هر قسمت و امتداد آن در قسمت بعدی در جهت مخالف و ادامه این کار، کلونی های تک به دست می آید. با کشیدن هر خط در هر قسمت تراکم باکتری ها کم می شود. به طوریکه وقتی در قسمت اول وقتی تراکم کم است، ابتدای قسمت دوم شروع شده و تراکم کم و کمتر می شود تا این که در قسمت چهارم می توانیم به باکتری تکی و خالص برسیم. به باکتری های تکی و خالصی که با انجام درست این روش به دست می آید، باکتری مادری می گویند.

در محیط کشت باکتریایی مایع، یکبار لوب داخل محیط حاوی باکتری شده و با ریختن روی محیط پیش ریخته، به صورت خط های موازی کشیده می شود.

کشت سطحی در پلیت

در این روش که بیشتر برای محیط های مایعی کاربرد دارد (شناسایی میکروارگانیسم های موجود در شیرهای مشکوک به آلودگی)، از محیط پیش ریخته استفاده می شود. در این روش با به کارگیری یک پیپت استریل مقداری از یک مایع با رقت معین برداشته و با استفاده از یک میله پخش کننده به داخل محیط پیش ریخته پخش می شود. کلونی های رشد یافته بعد از انکوباسیون در سطح محیط کشت قابل مشاهده خواهند بود.

خشک بودن سطح محیط کشت در کشت سطحی مهم است.

کشت آمیخته در پلیت یا پورپلیت

سوسپانسیونی از باکتری در این روش کشت باید تهیه شود. ابتدا به میزان یک سی سی از محیط مایع با رقت معین، داخل ظرف پلیت می ریزند. در مرحله بعد با اضافه کردن ۱۵ تا ۲۰ سی سی از محیط کشت استریل شده با دمای ۴۵ درجه سانتی گراد، آن را به شکل عدد انگلیسی ۸ به صورت دورانی مخلوط می کنند. در کشت دو لایه سطح مخلوط را دوباره با لایه باریکی از همان محیط کشت می پوشانند.

کشت در محیط مایع

ابتدا درب محیط لوله یا پلیت را در جلوی شعله بردارید. در این روش نیز حلقه پلاتین را استریل کرده و بعد از آلوده کردن آن به باکتری، آن را به دیواره لوله ای که بعد از حرارت دادن، سرش را کج کرده اند، می سایند. باکتری ها بعد از راست کردن لوله وارد محیط می شوند. دهانه لوله نیز در اینجا بعد از عبور از شعله، استریل می شود. در نمونه مایع، حلقه پر از مایع در محیط کشت مایع وارد می شود. بعد از وارد کردن میله آغشته به باکتری به محیط کشت، به آرامی هم زده می شود تا محیط همگنی به دست آید. با استریل کردن دهانه لوله، درب آن را گذاشته و در انکوباتور قرار می دهند. در انتها حلقه پلاتین سوزانده می شود و در جای خود قرار می گیرد.

روش ایزولیشن (جدا کردن باکتری ها)

در صورت وجود بیش از یک نوع باکتری، روش کشت با پرگنه مجزا به دست می آید تا خواص حیاتی هر کدام با برداشت از پرگنه خالص به دست آید. در این روش نیز محیط می تواند مایع یا جامد باشد و در پلیت انجام می شود.

کاربرد کشت باکتری

در مواد غذایی، آب، خاک، روی پوست، دستگاه روده و در محیط و بدن انسان (میلیاردها باکتری) وجود دارد. باکتری های بدن در مقابل عواملی که به بدن حمله می کنند مبارزه می کنند. تقسیم باکتری ها از گونه های نشأت گرفته از محیط، برای مطالعه و بررسی خصوصیات کشت، ریخت شناسی و فیزیولوژیکی یک گونه مهم است. عامل بیماری باکتریایی در باکتری رگه ای می تواند قابل شناسایی باشد.

انواع محیط کشت

سه نوع محیط کشت با توجه به نوع بستر آن وجود دارد. اولی محیط کشت جامد (آگار) است که دارای آگار بوده و می تواند داخل لوله آزمایش یا ظروفی انجام شود که پلیت نامیده می شود. از این روش برای کشت میکروارگانیسم های گرمادوست (دمای ۵۰ تا ۷۰ درجه سانتی گراد) استفاده می شود. از انواع این محیط کشت نوترینت آگار یا بلاد آگار است. دومین محیط کشت، مایع (براث) است که آگار نداشته و می تواند در لوله آزمایش یا فلاسک انجام می شود. این محیط کاربرد زیادی دارد. به عنوان مثال رشد مایکوباکتریوم در محیط مایع سریعتر از محیط جامد است. در محیط کشت نیمه جامد که سومین محیط کشت است، محیطی با ۰,۵ درصد یا کمتر از آن از آگار می باشد. این محیط که برای رشد باکتری های میکروآیروفیل مناسب است دارای قوامی شبیه به کاستارد است.

محیط کشت سلولی

برای رشد برخی از ویروس ها و باکتری ها از محیط های کشت سلولی استفاده می شود. سلول ها یکبار کشت می شوند قبل از این که آلوده شوند و یکبار با آلوده کردن با باکتری محیط کشت سلولی می تواند شناسایی شود.

گزارش کار کشت باکتری

باکتری ها مانند همه موجودات زنده به محیطی مناسب برای رشد نیاز دارند. این محیط باید چندین فاکتور مختلف را که از رشد باکتری حمایت می کند، برآورده کند. چنین عواملی شامل اکسیژن، pH، دما و نور مورد نیاز است. هر یک از این عوامل ممکن است برای باکتری های مختلف متفاوت باشد و انواع میکروب هایی را که در یک محیط خاص پراکنده می شوند محدود کند. باکتری ها را می توان بر اساس نیاز به اکسیژن یا سطح تحمل آنها دسته بندی کرد. باکتری هایی که نمی توانند بدون اکسیژن زنده بمانند به عنوان هوازی اجباری شناخته می شوند. این میکروب ها به اکسیژن وابسته هستند، زیرا در طی تنفس سلولی اکسیژن را به انرژی تبدیل می کنند. برخلاف باکتری هایی که به اکسیژن نیاز دارند، سایر باکتری ها نمی توانند در حضور آن زندگی کنند. این میکروب ها بی هوازی اجباری نامیده می شوند و فرآیندهای متابولیکی آنها برای تولید انرژی در حضور اکسیژن متوقف می شود.

یکی دیگر از عوامل مهم برای رشد باکتری ها pH است. دما نیز یکی دیگر از عوامل مهم برای رشد باکتری است. باکتری هایی که در دمای متوسط ​​(۲۰-۴۵ درجه سانتیگراد / ۶۸-۱۱۳ درجه فارنهایت) رشد می کنند، مزوفیل نامیده می شوند. اینها شامل باکتری هایی هستند که بخشی از میکروبیوم انسان هستند که رشد مطلوبی را در دمای بدن یا نزدیک به آن (۳۷ درجه سانتیگراد / ۹۸.۶ درجه فارنهایت) تجربه می کنند.

یکی از کارهایی که در آزمایشگاه میکروب شناسی باید انجام دهید نوشتن گزارش کار است. گزارش کار به یادگیری بهتر آزمایش ها کمک کرده و باعث می شود به خوبی روند آزمایش را یاد بگیرید. برای نوشتن گزارش کار کافی است روش کار را مکتوب کرده و نتایجی که به دست آورده اید را در آن بنویسید. سپس آن را به مسئول آزمایشگاه تحویل بدهید.